干旱是限制农业生产的主要非生物胁迫之一。先前的田间实验表明，干旱会降低根和根际的微生物群落多样性，但这些变化最终如何影响植物生长仍不清楚。本研究利用多尺度和多系统分析，鉴定出严重影响干旱胁迫植物表型的关键根部相关微生物。
英文题目：Identification of beneficial and detrimental bacteria impacting sorghum responses to drought using multi-scale and multi-system microbiome comparisons
中文题目：利用多尺度和多系统微生物组比较鉴定影响高粱干旱响应的有益和有害细菌
许多因素会影响植物的整体生长健康和生产力，包括品种差异(GP)、非生物胁迫(E)以及在植物内部和周围的微生物多样性(GM)。植物微生物群的组成以及时空变化，也受到环境条件和宿主的影响，进而构成了错综复杂的相互作用网络(PlantHealth = GP × GM × E）。前人研究这种相互作用网络一般有两种方法：基于田间调查和受控系统实验。
在实地调查中，下一代扩增子测序用于直接量化与植物相关的微生物成分，通常跨越各种非生物胁迫。这些实验将微生物分组为分类单位，通常在科或属水平上，可用于观察主要的群落变化/差异。例如，有充分证据表明，与大块土壤相比，根和根际含有的微生物多样性要少得多，这表明植物根部会影响其微生物组的组成。同样，先前的研究表明，干旱降低了30种被子植物和18种作物（包括高粱）根部微生物的多样性。值得注意的是，在这些研究中，放线菌菌株在大块土壤中富集，在根中甚至更富集。根据这一观察，假设这些革兰氏阳性（单胚层）细菌表现出对干旱的固有生理适应以及对干旱下植物代谢变化的反应。此外，一些研究表明，当植物宿主遭受非生物/生物胁迫时，它们会招募能够缓解压力的特定微生物，这被称为“求救”假说。
在这里，研究者测试了影响拟南芥根系生长的微生物合成群落(SynComs)，以确定是否在高粱上观察到类似的微生物依赖性表型。研究者在高粱发芽试验和高粱表型试验中测试了SynComs，发现Variovorax菌株可以保护高粱生长免受干旱和各种细菌菌株胁迫导致的根生长抑制(RGI)。与此同时，研究者在水分充足和干旱的条件下进行了高粱田间试验。鉴定出对干旱有响应的微生物，包括与之前的发现一致的放线菌集合。此外，从表型分析和田间试验中发现了有益和有害的高粱相关细菌。观察到几种细菌在两个系统中都具有表型效应。研究结果表明Arthrobacter菌会损害高粱的生长，尤其是在干旱胁迫下。这是利用简化论和生态学方法，揭示与宿主植物性状相关的特定微生物相互作用的首次报告。
使用发芽纸的高粱根生长测定。本研究中使用53种细菌菌株，合成群落 (SynComs)是等量的单个细菌培养物以更大的体积组合，使得最终接种物为 OD 600 = 0.5。高粱种子在密闭干燥器中用氯气进行表面消毒，然后浸泡在10 mL无菌水（对照）或细菌接种物（个体菌株或SynComs），在室温下过夜。种植后4天和7天(DAP)使用文档扫描仪对高粱根部进行成像。使用 ImageJ 手动测量主根长度伸长率。
使用 Lemnatec 高通量表型平台对高粱生长进行测定。DNA提取为每株植物收集四个根部和附着的土壤样本。使用试剂盒对磨碎的根和土壤样品进行DNA提取。细菌16S rRNA基因测序是使用引物对V4-V5区域进行扩增子测序及生信分析。与植物表型和微生物组丰度相关的变化点模型分析，对每个OTU的校准丰度与植物表型、植物面积和新鲜枝条重量相匹配，使用R chngpt包提供的变点模型。如果两种植物表型的估计阈值后线的斜率显着非零，则认为OTU为命中。重要的OTU使用 R UpSetR 提供的函数 upt 进行可视化。
高粱田间试验的现场布局和实验设计：采用八个重复区组进行两次浇水处理和24个高粱基因型的区域种植设计。为充分浇水的处理提供 31.75 厘米的水，为缺水处理提供 3 厘米的水。浇水良好的地块每 7-10 天灌溉一次，对缺水的地块进行初始灌溉以使作物长出，然后停止灌溉。之后进行田间收获测量和微生物组采样。测量了各种土壤特性（pH、阳离子总和、碱饱和度、可溶性盐、有机质、硝酸盐-氮、磷、钾、钙、镁、钠、硫、锌、铁、锰和铜）。然后评估这些特性中的每一个对植物表型的影响，然后进一步评估特性之间的相关性。现场样本采集和 DNA 提取，从每个地块中两种植物的根、根际和大块土壤中提取 DNA，之后进行 16S rRNA 基因扩增子测序。DNA进行质检定量后，然后进行细菌 16S rRNA V4 区域扩增子测序。使用叶绿体和线粒体肽核酸 (PNA) 阻滞剂来防止根内样品中的叶绿体和线粒体扩增干扰。
合成菌群群落和特定Arthrobacter菌株对高粱幼苗的根系生长抑制
前人研究表明，特定的合成菌群群落会导致拟南芥中的根系生长抑制(RGI) 表型。为了研究 SynComs 是否在高粱中引起相似的表型，本实验进行了高粱发芽试验。为该测定构建了三个SynCom：SynCom A由来自SynCom的24株菌株组成，不会在拟南芥中引起RGI；SynCom B由选自SynComs的29个菌株组成，这些菌株在拟南芥中引起RGI；SynCom B + V由29个SynCom B菌株和来自SynCom A 的6个Variovorax 菌株组成。研究者进行了高粱幼苗发芽袋试验，以评估 SynComs 对高粱根发育的影响。结果表明，与对照相比，SynCom A 和 B + V处理的高粱幼苗具有更长的初生根，而 SynCom B处理的幼苗显示出最短的根（图 1a）。这些数据表明SynCom A和B分别促进和抑制高粱根的生长。结果还表明SynCom B + V中的Variovorax菌株抑制SynCom B引发的RGI表型。这些结果与之前报道的拟南芥和番茄一致。
接下来，研究了单个菌株对RGI表型的贡献。使用发芽测定法测试每种菌株（图1b）。在7个DAP时，53 个菌株中的11个菌株与对照幼苗相比在高粱中引起RGI，其中大部分属于SynCom B。此外，该测定表明9个SynCom A菌株可以促进根生长，包括两个Variovorax菌株。在测试的53个菌株中，有14个曾被报道在拟南芥中引起RGI。其中，只有两种菌株也能诱导高粱短根，均为Arthrobacter菌株。
图 1、合成菌群群落(SynComs)和单个菌株在快速幼苗试验中高粱根长表型的影响。绿点代表单株高粱幼苗的根长。a）不同处理的箱线图。b）单独测试每个菌株(1-53)对高粱幼苗根系生长的影响。灰点代表对照（无细菌处理）幼苗。黑色实心点和线代表平均值±标准偏差。
在高通量、受控环境实验中，干旱和微生物处理改变了高粱的生长
基于图1数据，研究者假设SynCom B处理的高粱对干旱等非生物胁迫的敏感性增加，而SynCom A处理的高粱植物由于其根长表型而表现出相对耐受性。此外，研究者想研究SynCom介导的表型是否会转移到更复杂的非无菌环境条件下。为了解决这些问题，研究者使用高通量Bellwether表型分析平台（Lemnatec系统）进行了为期25天的实验，并测量了在水分充足和干旱条件下SynComs对高粱生长的地上表型影响。
高粱种子在微生物存在的情况下发芽，种植在蒸汽消毒的土壤中并装载到表型分析平台上。在开始干旱处理之前，所有花盆都充分浇水四天。对每株植物进行称重，然后在必要时浇水（低于目标重量）并每天成像，总共25天。收集了RGB和近红外(NIR)图像。NIR强度可用作含水量的代表，其中较低的值与较高的植物含水量相关。在实验结束时观察到植物面积、NIR 强度和枝条鲜重的这些模式（图2）。
图 2：SynComs在高通量表型分析中对植物生长表型的影响。植物大小(a)和NIR信号(b)的时间变化，线条颜色显示不同微生物处理。c）绿点代表测定结束时高粱的枝条鲜重。
Arthrobacter和Variovorax菌株在高粱根中定殖并持续存在
实验发现，SynCom A和SynCom B + V中的微生物可以保护高粱免受干旱胁迫，而SynCom B中的微生物加剧了干旱的负面影响。为了测试在实验开始时应用的微生物是否能够与高粱植物一起存在，并可能查明每个 SynCom 中在影响地上表型中起主要作用的特定微生物，研究者使用16S rRNA对每株植物的根微生物组进行了扩增子测序（图3）。这些数据表明，Arthrobacter和Variovorax菌株在高粱根中定殖并持续存在.
图3、使用16S rRNA扩增子测序对高粱根部相关微生物组的表征。a）使用无监督UMAP对微生物组样本进行聚类，颜色和形状分别显示干旱和微生物处理。b）微生物菌群在处理中的门水平分布。c） Variovorax和Arthrobacter的OTU丰度干旱下测定结束时的OTU。点代表不同样品中的OTU丰度，颜色显示微生物处理。d）与两种植物表型相关的OTU数量。颜色代表具有相同关联方向的OTU组。e）干旱处理中植物表型相关微生物群的门级分布。f-g）OTU194097 Arthrobacter菌株的OTU丰度与植物表型（f植株大小；g枝条鲜重）之间的变化点模型拟合。灰点表示不符合丰度阈值的样本。
Arthrobacter菌株在田间干旱条件下对高粱产生负面影响
在上述高通量表型实验的同时，研究者进行了大规模的田间实验。对24个高粱品种在水分充足和干旱条件下的表现进行了评估。收集了多组数据，包括最终收获时的植物性状（株高、鲜干和干茎重、穗重）、土壤化学成分和性质（钙、镁、磷酸盐水平等），以及来自每个地块（根、根际和土壤）三种样本类型。初步分析揭示了土壤因子空间分布异质性的有力证据。因此，所有植物表型都经过校准以排除土壤养分和空间效应。此外，使用线性回归和保留残差调整所有植物表型的基因型效应。经过土壤因子校准和基因型调整，植物生物量表型，包括植物茎重和株高，均表明干旱处理损害了植物生长（图 4）。
图4、干旱处理对田间试验中的高粱生长表型有负面影响。绿点代表高粱植物样品在调整土壤特性影响后的生长表型。
为了研究与每种植物相关的微生物组组成，从三种样品（根、根际和土壤）中提取DNA并进行16S rRNA扩增子测序分析（图5）。变形菌门、放线菌门、拟杆菌门和酸杆菌门是所有样品中最丰富的门。与水分充足的条件相比，干旱条件下放线菌的相对丰度更高。
图5、田间试验中干旱处理的高粱微生物组。a）使用无监督UMAP对微生物组样本进行聚类，颜色显示样本类型；b）干旱处理和不同样本类型的高粱微生物群的门级分布。c）与两种植物表型相关的OTU数量。d）干旱下植物表型相关微生物群的门水平分布。e-f）OTU37122 Arthrobacter菌株的OTU丰度与植物表型（e植物干重；f植物高度）之间的变化点模型拟合。
作为最后一步，研究者将用于高通量表型研究的方法，应用到了田间实验中，以识别推定的表型相关微生物。研究者使用株高和茎干重两种植物表型的变化建模。虽然Variovorax不在与植物表型正相关的 OTU中，但该分析发现其他几种候选有益细菌OTU（OTU2005、OTU53427和OTU202293）。
本研究证明，影响双子叶植物根系生长的Arthrobacter和Variovorax的特定分离株也会影响单子叶植物高粱的根系生长。通过无菌、受控环境和田间实验的三种系统性检测，确定了一个高可信度的新型候选有益微生物列表。这种系统级方法使研究者能够减轻环境因素干扰，以揭示潜在的强大的生物间相互作用。
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