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实验流程：

经典案例解读

案例1：用乙醇处理中国甜柿果实转录组分析

背景：

柿子是一个重要的商业和落叶果树。果实的原花青素（PA）含量占干重百分比超过25%，因此口感很涩。原花青素引起的涩味，往往不容易被人接受，因此，除去涩味在柿子产业变得十分重要。把柿子放在含有稀乙醇的聚乙烯袋子中可以将可溶性的原花青素转换为不可溶性的原花青素。由于其庞大而复杂的基因组，柿子基因组资源的开发被推迟了。

方法：

     •  收集处理和不处理样本， 5%乙醇处理的柿子和不含5%乙醇处理的柿子
     •  进行mRNA-seq
     •  Unigenes的 GO分析，KEGG分析
     •  确定处理和不处理样本中的差异表达基因
     •  qPCR验证转录组数据得到的差异表达基因是否准确

结果：

1.鉴定到83898个unigene （平均长度1155bp），其中54,719 (65.2%) unigenes被注释。

2.24,337 unigenes可以被GO term 分类，其中参加代谢过程的基因数目最多。

3.KEGG分析发现，参与糖代谢，氨基酸代谢等代谢生物过程的基因同样最多。在第二级代谢分类中，苯丙烷类生物合成基因数目最多。

4.通过比较乙醇处理和不处理样品的转录组数据发现3639 个基因表达差异明显（ 在处理样品中1560 个基因表达上调，2079个基因表达下调）。 通过对原花青素合成基因和单宁酸凝固相关基因的QPCR实验验证，证明转录组数据是准确的。

参考文献：Chun Luo et al. Genome-wide transcriptome analysis of Chinese pollination-constant nonastringent persimmon fruit treated with ethanol. [J]. BMC Genomics. 2014 Feb 8;15:112. doi: 10.1186/1471-2164-15-112.

案例2：山羊地方动物性鼻腺癌新的和差异表达miRNAs鉴定

背景：

miRNAs在涉及真核细胞生长、发育、代谢等多种基因的转录后调节，以及参与癌症的启动和进程中起着非常重要的作用。地方动物性鼻腺癌（ENA）是由地方性鼻肿瘤病毒（ENTV）引起的山羊和绵羊的上皮肿瘤，是一种慢性、渐进性、接触传播的疾病。

方法：

     •  用ENTV病毒侵染的山羊，收集癌和癌旁组织
     •  上机测序
     •  确定ENA中差异表达miRNAs鉴定
     •  对差异表达miRNAs基因的功能分析
     •  qPCR验证所得差异表达基因是否准确

结果：

5.测序获得癌和癌旁组织的clean reads和unique reads统计

6.鉴定到435个miRNA，其中116个miRNA在癌和癌旁组织中表达显著差异。

7.对样品中表达差异miRNA的GO分析发现，有1792个GO分类得到显著性富集，主要参与转移酶活性，质膜及血管发育等代谢生物过程的基因等。

8.通过比较山羊ENA癌和癌旁的差异表达miRNA的KEGG分析发现，267个KEGG得到富集，其中97个有显著差异（P<=0.05），主要涉及了肿瘤免疫系统信号转导等。

9.通过对在GO和KEGG分析中有代表性的5个miRNAs和两个新发现的miRNAs的表达进行qPCR实验验证，证明测序数据是准确的。

参考文献：Wang Bin et al. Identification of novel and differentially expressed MicroRNAs in goat enzootic nasal adenocarcinoma. [J]. BMC Genomics. 2016 17:896. doi: 10.1186/s12864-016-3238-5.