技术参数及分析内容

技术优势：

  • 数据量大：不低于15万reads/样品，可检测环境微生物群落中的痕量菌，以及发现新的微生物。
  • 性价比高：可同时获得样本菌群的相对定量分析结果和绝对定量分析结果。
  • 适用范围广：可同时得到包括低丰度菌在内的绝大多数物种的绝对定量数据，具有普遍适用性。
  • 真实准确：绝对定量数据，客观还原菌群结构及真实丰度，无样品偏差可直接比较，此外可以排除环境样本（例如土壤，水体和淤泥）中腐殖酸等PCR抑制剂对微生物绝对定量的影响。

技术参数

分析流程

天昊项目文章

项目文章1（土壤）：长期施氮降低了捕食性粘细菌的相对丰度和绝对拷贝数，改变了土壤中粘细菌群落结构

英文题目：Long-term nitrogen application decreases the abundance and copy number of predatory myxobacteria and alters the myxobacterial community structure in the soil

期刊名：Science of the Total Environment

影响因子：6.551

研究概要:

粘细菌是一种具有特殊社会生活方式（Social lifestyle）的微生物捕食者，这种社会性细菌（Social bacteria）在细菌域是独一无二的。这些捕食者在土壤微生物食物网中代谢活跃，具有驱动土壤微生物种群的能力。然而，施肥处理对农业系统中捕食性粘细菌的影响常常被忽视。本文采用高通量绝对丰度定量方法，对湖南祁阳红壤试验站施肥29年的农田中的粘细菌相对丰度和绝对拷贝数进行了研究。利用16S扩增子绝对定量测序技术，共检测到419个粘细菌OTUs，占细菌总丰度的0.25-2.70%。PCoA、ANOSIM和Manhattan analysis结果表明，施氮（N簇）和施猪粪（M簇）的粘细菌群落结构存在显著差异（p<0.05）。施加氮肥显著降低了粘细菌的相对丰度、拷贝数、物种积累指数和Shannon指数（p<0.05）。UpSet plots结果表明，氮肥处理的粘细菌OTUs数量仅为猪粪（M）处理的24.4%，施氮造成低丰度粘细菌OTUs数量的减少。此外，网络分析、RDA分析和随机森林RF分析表明，粘细菌相对丰度和绝对拷贝数是预测土壤细菌群落和功能基因α-和β-多样性的重要变量（P<0.05）。研究结果表明，施氮肥引起的土壤酸化是导致土壤粘细菌相对丰度和绝对拷贝数下降的最主要原因；粘细菌相对丰度和绝对拷贝数的变化与细菌的α-和β-多样性指数的变化显著相关，粘细菌群落的变化可能是影响整体微生物群落变化的重要因素。

实验设计：

长期试验田于1990年在中国农业科学院祁阳红壤实验站建立，设计了12种常用施肥处理：1）不施肥对照（control, CK）；2）氮化肥 （N）；3）氮磷化肥 （NP）；4）氮钾化肥 （NK）； 5）磷钾化肥 （PK）；6）氮磷钾化肥 (NPK)；7）氮磷钾化肥配施猪粪 (NPKM) ；8） 1.5倍用量的氮磷钾化肥配施猪粪（1.5NPKM）；9）氮磷钾化肥配施秸秆；10）氮磷钾化肥配施猪粪+大豆轮作（NPKMR）；11）猪粪（M）；12）休耕（Nature）。每种处理共采集四个土壤样品（生物学重复），随机选择三个样本用于进一步研究。

细菌绝对定量测序：

使用FastDNA? SPIN Kit for soil (MP Biomedicals, Santa Ana, CA)提取土壤DNA，然后在上海天昊生物科技有限公司进行细菌绝对定量测序（V4-V5区域）。

图1 施肥处理对土壤粘细菌群落相对丰度（A）和拷贝数（B）的影响，以及基于相对丰度与拷贝数PCoA 轴1的相关关系（C）。

图3 曼哈顿图显示了M处理土壤相对于N处理土壤中富集的粘细菌的相对丰度（A）和绝对拷贝数（B）。显著富集的OTUs被描绘为填充三角形，显著减少的OTUs被描绘为空心三角形，不显著的OTUs被描绘为全圆。虚线对应于p值=0.05显著性阈值。每个点的颜色代表了OTU（科水平）的分类隶属关系，每个点的大小对应于36个土壤样品中OTU的平均相对丰度或绝对拷贝数。

项目文章2（生物膜）：中试规模两级潮汐流人工湿地中多孔基质和功能菌属的协同作用对低温下营养物质的高效去除

英文题目：The synergy of porous substrates and functional genera for efficient nutrients removal at low temperature in a pilot-scale two-stage tidal flow constructed wetland

期刊名：Bioresource Technology

影响因子：7.539

研究概要:

以页岩陶粒（SC）和活性氧化铝（AA）为填料，构建日处理量为0.46 m3 / d的中试规模两级潮汐流人工湿地TFCW（SC-AA-TFCW），用于低温（<15℃）营养物质的去除。SC-AA-TFCW对氮和磷的去除率分别为78.1%和98.3%。SC-TFCW对有机物的去除率为55.2%，对颗粒物的去除率为85.6%。在17种反硝化细菌中，好氧反硝化细菌（ADNB）的绝对丰度最高，其次是兼性厌氧反硝化细菌（FADNB）和自养反硝化细菌（AUDNB）。氮同化为有机氮、异化同化硝酸盐还原和完全反硝化(完全脱氮)可能是氮代谢的主要途径。一些好氧反硝化细菌（ADNB）（如Zoogloea, Pseudomonas和Acidovorax）与营养物质去除相关的关键功能基因之间存在正交互作用。溶解氧和还原元素是改变好氧反硝化细菌（ADNB）组成的主要环境因素。 这项研究强调了好氧反硝化细菌（ADNB）的重要性及其在SC-AA-TFCW中对多孔基质的协同作用。

SC-AA-TFCW的构建和运行：

实验是在中型SC-AA-TFCW上进行的，该SC-AA-TFCW由SC-TFCW和AA-TFCW组成，并具有相同的配置（长×宽×高=1000 mm×800 mm×800 mm）。每个下行TFCW主要由入口区、基底区和出口区组成（图1）。相邻区域由隔板隔开，隔板上有均匀分布的小孔，用于分配水。在进水区，建立了由多孔PVC管组成的水分配器，以实现均匀的水分配。基底区域（长×宽×高=1000mm×800mm×600mm）全部填充SC或AA。美人蕉（Canna indica L.）以16株/m2的初始密度种植在每个TFCW基质区上表面。为了保持进水水质稳定性，合成废水的平均浓度保持在300 mg / L化学需氧量（COD），40 mg / L NH4 +-N，5 mg / L总氧化氮（TON，亚硝酸盐和硝酸盐之和），2 mg / L PP和4 mg / L TDP。根据这些平均值，分别用葡萄糖，NH4 Cl，KNO3，骨粉（直径<0.074 mm）和KH2 PO4制备合成废水。SC-AA-TFCW通过自动控制系统连接，该系统由进水箱，污水泵，电磁阀和液位传感器组成。“潮汐运行”模式（填充-接触-排水-休息）的实施策略如下：1）为了在启动阶段（从第1天到第41天）在SC和AA中更快地进行生物降解，进水池的废水通过启动泵、电磁阀1和电磁阀2快速（3分钟）加载到SC-TFCW上，接触时间为2小时，之后通过启动泵、电磁阀3和电磁阀4将所有废水快速（3分钟）加载到AA-TFCW上，并与基质保持接触2小时，然后启动电磁阀5将废水快速排出；2） 为了在稳定阶段（第42天至第114天）更稳定地去除氮和磷，在其他操作参数不变的情况下，AA-TFCW的接触时间从2小时延长到10小时。

样品采集与测定：

每周两次从每个TFCW的入口和中间收集水样。根据标准方法（APHA，2012）测量了包括COD、NH4 +-N、NO2?-N、NO3?-N、TN、TDP、PP和TP等参数。借助于便携式Hach HQ30d多参数分析仪测量溶解氧（DO），pH和温度。在第10天、第41天、第60天和第114天，从每个TFCW的中间位置采集三份微生物样本，将三份样品混合作为一个生物膜样品，用于进一步的微生物分析。本研究采集了8个生物膜样品，包括SC10、AA10、SC41、AA41、SC60、AA60、SC114和AA114。

细菌绝对定量测序：

使用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit (Omega Biotek, U.S.)从8个生物膜样品中提取微生物DNA。DNA样品送至上海天昊生物科技有限公司进行细菌绝对定量测序（V3-V4）。

图4 SS-AA-TFCW中8个生物膜样品的主要属（至少一个样本绝对拷贝数>1500 copy/ng DNA）的绝对定量：（a）主要细菌属的热图；（b）潜在反硝化菌的总丰度。图（a）中的1、2、3分别代表好氧反硝化细菌（ADNB）、兼性厌氧反硝化细菌（FADNB）和自养反硝化细菌（AUDNB）。

项目文章3（粪便）：绿刺参岩藻糖基硫酸软骨素的链构象、理化性质及其体外发酵

英文题目：Chain conformation, physicochemical properties of fucosylated chondroitin sulfate from sea cucumber Stichopus chloronotus and its in vitro fermentation by human gut microbiota

期刊名：Carbohydrate Polymers

影响因子：7.182

研究概要:

本文采用HPSEC-MALLS和worm-like cylinder模型方法研究了绿刺参岩藻糖基硫酸软骨素(fCS-Sc)的链构象和理化性质，同时通过16S扩增子绝对定量测序研究它对人体肠道菌群的影响。结果表明绿刺参岩藻糖基硫酸软骨素(fCS-Sc) 在PBS中采用刚性棒状链构象，链构象参数分别为αη（1.11）和αh（0.70）。从worm-like cylinder模型推导出的刚度参数表明fCS-Sc表现为刚性链。刚果红分析显示为单螺旋结构。fCS-Sc在较宽的ph范围内表现出负的zeta电位和良好的热稳定性。此外，fCS-Sc还可以通过提高肠道菌群的绝对丰度来调节肠道菌群的群落结构，例如增加有益菌Megamonas、Bacteroides、Fusobacterium、Parabacteroides、Prevotella、Faecalibacterium，抑制病原微生物，从而促进短链脂肪酸的产生。本研究进一步加深了对fCS-Sc空间结构的认识，以及fCS-Sc作为益生元的应用。

fCS-Sc体外发酵：

根据文献报道，对fCS-Sc进行了体外发酵研究。将fCS-Sc或低聚果糖（FOS，阳性对照）溶于培养基中（10mg/ml），高压灭菌。新鲜粪便样本来自三名自愿捐赠者（两名女性和一名男性，年龄25-35岁），他们在三个月内没有胃肠道疾病或抗生素治疗。将每个供者的相同量粪便样本混合，用PBS稀释成10%（w/v）的粪浆，以500rpm离心5min，除去食物残渣。然后，将9ml空白培养基（对照组）或含fCS-Sc或FOS的培养基与1ml粪浆混合。将混合物立即放入厌氧培养箱中，37℃孵育24小时。在Silgreen阳离子交换柱（300×7.8mm）上分析培养基中的SCFAs含量，用8mM H2 SO4洗脱，215nm检测。

细菌绝对定量测序：

使用FastDNA? SPIN Kit (MP Biomedicals, LLC, USA)提取样本微生物基因组DNA，然后在上海天昊生物科技有限公司进行细菌绝对定量测序（V3-V4）。

图6 主要细菌在门（a）和属（b）水平上的相对丰度和绝对丰度

结果展示

1) 样本OTU代表序列对应物种16S rRNA基因绝对拷贝数计算

a) 向样本中添加内标序列，然后对样品DNA和内标序列DNA进行16S扩增子测序。
b) 使用内标序列 DNA的序列数，结合其绝对拷贝数，以log（copies）为横坐标，log（reads）为横坐标，绘制标准曲线：

图1 Y4样品的标准曲线

c) 根据标准曲线计算的样品中优势OTU序列(Top10)的起始拷贝数：

表1 根据标准曲线计算的样品中优势OTU序列(Top10)的起始拷贝数

d) 根据各样品内部的标准曲线计算出各样本总细菌绝对拷贝数和各菌绝对拷贝数情况：

2) 内标序列的添加对样本原有群落组成影响不大

以下是比较淤泥样本A两次测序结果，两次测序编号分别为A_V4（未添加内标序列）、Y42_V4（添加10⁶ copies 内标序列）。
a. 同一样本添加不同拷贝数内标序列测序物种相对丰度比较：

结果显示：Y4_V4、Y42_V4样本优势菌属完全一致，且这些菌属在各个样本中的相对丰度比较一致，说明内标序列的添加对样本属水平的群落组成无明显影响，添加内标序列后的样本16S测序结果也能反映样本本身群落组成情况。

b. 同一样本添加不同拷贝数内标序列得到的优势OTU代表序列拷贝数：

结果显示：比较同一样本中添加不同量内标序列测得的优势OTU代表序列的绝对拷贝数，结果发现Y42_V4（添加10⁶ copies 内标序列）和Y4_V4（添加10⁷ copies 内标序列）同一OTU代表序列拷贝数一致性较好，说明Accu16S^TM细菌绝对定量测序的重复性和稳定性均较好，能够真实定量出样本中各个物种的绝对丰度。

3）Accu16S^TM细菌绝对定量测序和qPCR绝对定量相比，准确度在同一水平

较了Accu16S^TM细菌绝对定量测序方法与荧光定量qPCR方法所测定的同一系列样本的细菌总拷贝数，Pearson相关性分析结果显示：相关系数大于0.9，且两种方法计算的细菌总拷贝数值较为接近，未超过一个数量级，说明通过Accu16S^TM细菌绝对定量测序技术进行微生物绝对定量是可靠准确的。