常规微生物16S/18S/ITS扩增子测序-上海天昊生物-微生物绝对定量测序、宏基因组测序、甲基化检测、单细胞转录组测序、转录组测序、外泌体检测

常规微生物16S/18S/ITS扩增子测序

服务介绍：

扩增子测序就是通过对基因组目的区域进行PCR扩增，将目标区域DNA扩增富集后进行高通量测序，然后将得到的序列与特定数据库比对，确认物种，然后进行生物信息分析的研究策略。目前扩增子测序服务主要包括细菌16S rDNA区/真菌ITS1区/真菌ITS2区/真菌18SrDNA区测序以及后续的数据分析工作，可有效研究特定环境中的物种信息，包括：物种差异、物种分类、物种丰度，对土壤，水体，瘤胃，淤泥等复杂环境中的微生物构成研究有重要的指导作用。

16S rDNA测序:

16SrRNA为核糖体的RNA的一个亚基，16SrDNA就是编码该亚基的基因，存在于所有细菌基因组。16S rDNA大小适中，约1.5Kb左右，同时具有高度的保守性和特异性。16S rDNA既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，目前已被广泛用于病原菌的检测和鉴定。

18S rDNA测序:

18S rDNA为编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列。在结构上分为保守区和高变区，保守区反映生物物种间的亲缘关系，高变区反映物种间的差异，18S rDNA在进化速率上相对于ITS更加保守。

ITS 测序:

在真核生物中，18S rDNA和28S rDNA转录间隔序列称为ITS区。ITS分为两个区域：ITS1/ITS2，ITS1位于18S和5.8S之间，ITS2位于5.8S和28S之间。ITS由于是非转录区，承受的选择压力较小，变异强。

技术参数及分析内容

技术优势

   • 无需培养分离菌群，直接针对环境样本进行扩增子测序。
   • 高通量测序，大数据量、低花费。
   • PCR扩增设置多次重复，低循环数扩增，客观还原菌群结构及丰度比例。
   • 可发现环境微生物群落中新的微生物和基因，以及检测痕量菌

技术参数

试验流程

经典案例解读

项目文章1：苦丁茶和茯砖茶可通过调节肠道菌群来预防肥胖

英文题目：Kudingcha and Fuzhuan brick tea prevent obesity and modulate gut microbiota in high-fat diet fed mice

中文题目：苦丁茶和茯砖茶通过调节高脂饮食喂养小鼠的肠道菌群来预防肥胖

期刊名：Molecular Nutrition & Food Research

发表时间： 2018年

影响因子：4.323

研究对象:

32只雄性C57BL/6小鼠分为4组（每组8只）：第一组小鼠给予正常饮食喂养+200微升水（ND组）、第二组小鼠给予高脂饮食喂养+200微升水（HFD组）、第三组小鼠给予高脂饮食喂养+200微升的400 mg/kg/day苦丁茶(KDC)提取物（HFD-KDC组）、第四组小鼠给予高脂饮食喂养+200微升的400 mg/kg/day茯砖茶(FBT)提取物（HFD-FBT组）。每组小鼠驯化一周后灌胃8天。每周测量食物摄入量和体重。粪便、肝、血、肾周脂肪组织和附睾脂肪组织实验结束时收集，立即在液氮中冷冻保存在-80℃。

生化分析、内毒素血症和细胞因子测定:

• 用商业试剂盒测定血清中的甘油三酯(TG)、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平及甘油三酯含量。
• 用商用试剂盒测定肝脏中的甘油三酯(TG)、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量。
• 用商业ELISA试剂盒测定血清中的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、脂多糖（LPS）和C-反应蛋白。

宿主基因表达量检测:

使用qPCR测定肝脏脂质代谢相关基因表达量：肉毒碱棕榈酰转移酶-1（CPT-1）、过氧化物酶体增生物激活受体α(PPARα)、过氧化物酶体增生物激活受体γ(PPARγ)、固醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）、脂肪酸合酶（FAS）、肝X受体α(LXRα)。

肠道菌群分析:

细菌16S扩增子测序区段为：（V4）；

主要结果

1. 苦丁茶(KDC)和茯砖茶(FBT)减弱HFD喂养小鼠的肥胖特征：

• 在8周的饲养试验中，高脂饮食（HFD组）小鼠的体重明显增加，附睾和肾周脂肪积累，肝重和肝脏TG含量增加。但是补充FBT或KDC提取物能明显减轻体重，这正好与附睾和肾周脂肪积累显著下降，肝重和肝脏TG含量减少相符，并且这些指标与ND对照组没有显著差异。
• 检测了血清生化指标，包括TG、TC、LDL-C和HDL-C水平。据观察，高脂饮食导致TC和LDL-C水平显著增加，和HDL-C水平显著降低。补充FBT能显著降低TG和LDL-C水平。这些结果表明，在FBT能减轻高脂饮食喂养小鼠血脂特征，而KDC对血脂水平的影响有限。

2. FBT和KDC对高脂饮食喂养小鼠肝脏氧化损伤，血清炎症和内毒素血症的影响：

• 据报道，高脂饮食可导致肝高氧化应激，有助于肝脏脂质沉积，从而导致肝脏的许多疾病。肝脏中的抗氧化酶如SOD、CAT和GSH-Px在控制脂质过氧化反应中起着重要作用。本研究发现高脂饮食导致肝脏中SOD, CAT和GSH-Px水平降低， MDA水平升高。而KDC和FBT则可以显著预防高脂饮食诱导的肝脏氧化应激参数改变，例如KDC和FBT可以使SOD, CAT和GSH-Px水平升高，MDA水平降低。
• 促炎性细胞因子和内毒素水平的升高已被报道与高脂诱导小鼠的肥胖相关疾病相关。本研究确实发现，相对于ND对照组，HFD组血清中具有更高水平的LPS、TNF-α、IL-6和CRP。而KDC和FBT则可以使LPS、TNF-α、IL-6和CRP水平显著降低。

3. FBT和KDC调控脂质代谢相关基因的表达：

• 以往的研究表明，高脂饮食HFD可以调控肝脏脂肪酸合成和抗氧化基因的表达。实时定量PCR结果发现高脂饮食HFD引起LXRα, FAS, SREBP-1c和 PPARγ表达上调，CPT-1 和PPARα表达下调。而FBT与KDC可以显著降低FAS，SREBP-1c和PPARγ表达。

4. 肠道菌群对HFD, FBT和KDC的响应：

• 高脂饮食HFD可以降低肠道菌群的多样性，而FBT与KDC可以提高肠道菌群多样性至ND对照组水平，另外KDC在改善肠道菌群多样性方面效果更好。
• PCoA分析可以把ND组和HFD组明显分开（图4A，B），同时可以把HFD组、HFD-FBT 组和HFD-KDC组明显分开，这说明FBT与KDC对HFD喂养的小鼠肠道菌群确实有调节作用。PC1轴结果则说明FBT和KDC可以恢复被HFD破坏的肠道菌群结构至ND对照组水平。群落结构柱状图结果说明小鼠的肠道优势菌群是厚壁菌门和拟杆菌门（图4C）。HFD可以明显改变肠道菌群结构，例如厚壁菌门丰度增加同时拟杆菌门丰度降低，另外HFD可以显著提高厚壁菌门/拟杆菌门的比例，而FBT可以削弱这种增长趋势至对照水平
。 • 考虑到相同科水平下不同细菌对同一环境压力（例如HFD）的反应不同，因此非常有必要鉴定被HFD, FBT和KDC改变的特定细菌类型，结果发现HFD处理可以使69个OTUs丰度上调，53个OTUs丰度下调；KDC处理可以使22个OTUs丰度上调，16个OTUs丰度下调；FBT处理可以使37个OTUs丰度上调，37个OTUs丰度下调（图5）。被HFD影响的OTUs可以被KDC（30个）或者FBT（58个）逆转，因此在调整高脂诱导的肠道菌群方面FBT比KDC更加有效。

图4 FBT和KDC调节高脂饮食破坏的肠道菌群组成。（a）肠道菌群的PCoA分析；（b）样本UPGMA聚类树；（c）门水平肠道菌群的组成；（d）厚壁菌门，拟杆菌门相对丰度，以及厚壁菌门/拟杆菌门比例。

图5 被FBT或KDC改变的100个OTUs相对丰度。（a）100个OTUs相对丰度热图；（b）被FBT或KDC影响的细菌类群（门、科、属）变化方向。

项目文章2：不同冰川年代的土壤细菌和真菌群落具有不同组合方式和驱动力

英文题目：Divergent assemblage patterns and driving forces for bacterial and fungal communities along a glacier forefield chronosequence

期刊名：Soil Biology and Biochemistry

发表时间： 2018年

影响因子：4.857

研究目的:

尽管微生物在冰川地区成土过程和生态系统发展中无处不在，并且起着关键的生态功能，但是细菌和真菌有着截然不同的演替轨迹，并且关于群落的驱动力仍不清楚。在这项研究中，分析了海螺沟冰川变化的七个不同阶段相关细菌和真菌群落，量化其分类组成和演替动态，并从中解读植物建立、土壤发育和线虫对微生物演替轨迹的影响。

研究对象：

观察到的海螺沟冰川衰退始于1823年，自20世纪初以来已明显加速。这项研究是在7个经历长期初级演替的地点进行的，它们分别处于末次冰消期后的不同时间（从裸土到开荒植被群落，最终达到顶极植被群落）。每个阶段的大致年龄根据树的年轮和137 Cs评估的土壤侵蚀速率进行校正，最终分为7个时间阶段（1阶段：冰川衰退后3年，到7阶段：冰川衰退后120年）。
在每个时间阶段，使用3个5×5m的实验地块（在1和2阶段，因为区域较小所以使用2×2m地块）。植物群落的分类确定到种水平，以评估植物的丰富性（包括乔木，灌木和草本层），所有取样的植物材料按种类进行分类，然后烘干和称重。用一个直径为5厘米的土壤取样器从每块地中心和5个角落采集土壤样本，五份土壤混成一份样本，通过2mm筛除去根，约200克的土壤分为三个部分：（1）土壤理化性质分析；（2）土壤线虫群落分析；（3）土壤微生物生物量测定和DNA提取。

技术方法：

细菌16S rRNA扩增子测序（V4-V5）和真菌ITS1扩增子测序；

研究结果：

1. 微生物群落组成、结构和系统发育多样性：

    优势细菌主要是：变形菌门（44.19%）、酸杆菌门（21.25%）、拟杆菌门（9.11%）、浮霉菌门（4.1%）、放线菌门（3.57%）、绿弯菌门（3.10%）、芽单胞菌门（2.34%）和疣微菌门（2.03%）（图1a）。
    优势真菌主要是：子囊菌门(48.14%)、担子菌门(36.84%)、接合菌门(4.13%)（图1b）。分：（1）土壤理化性质分析；（2）土壤线虫群落分析；（3）土壤微生物生物量测定和DNA提取。
    NMDS分析能把细菌整体分为三个群：第1阶段为cluster1，第2-5阶段为cluster2，第6-7阶段为cluster3，三个cluster之间没有重叠（图1c）。NMDS分析能把真菌体分为2个群：早期（阶段1-5）和后期（阶段6 -7）（图1d）。与真菌相比，每个时间阶段的细菌聚集的更紧密（图1c和d）。

2. 共生网络分析

共生网络表明细菌和真菌群落的复杂性在中间时间阶段达到顶峰，其节点和边缘数量最高（图2）
细菌重叠的节点主要属于Proteobacteria（变形菌门）和Acidobacteria（酸杆菌门），真菌重叠的节点主要属于Ascomycota（子囊菌门）和Basidiomycota（担子菌门）（图2）。

3. 土壤和生物因素与微生物群落的关系

    通过冗余分析区分了3个细菌群落和2个真菌群落，在环境因子中，ph、总磷、土壤有机碳、凋落物C/N和植物丰富度与微生物群落密切相关（图3a和b）。
    变分分析表明相对于生物因素，土壤性质在确定细菌和真菌群落结构方面更为重要，尤其是在早期阶段1–5, 在最后的两个阶段，随着森林的建立，生物因素以及生物和土壤互作越来越重要（图3c和d）。
    结构方程模型表明，环境因素影响排名按以下顺序：1)细菌: 土壤全磷（0.66）、土壤pH值（0.64），土壤SOC（0.44）, 植物丰富度（0.36）和线虫放牧（0.25）; 2)真菌: SOC（0.62）, 食线虫（0.57）, pH值（0.52），植物丰富度（0.48）和总磷（0.10）（图3e、f）。

4. 不同生物群的反应和驱动力对比

四个生物群的丰富度和生物量表现出类似的反应。植物和线虫的丰富度反应最高，细菌的丰富度反应最低，另一方面，真菌的生物量反应最大，其次是细菌、植物和线虫。大多数生物群在第5阶段达到最大的丰富度，在第6阶段达到最大生物量，然后在后期下降。
随机过程支配细菌和真菌群落的变化，而确定性过程支配着植物群落的形成，相反，在线虫中确定性和随机过程大致相等。在最后两个阶段，决定论对细菌和真菌的重要性增加了，与细菌相比，真菌群落组成有更强烈的随机性驱动力。

图1 海螺沟冰川不同演替阶段的细菌（A，C）和真菌（B，D）物种组成和NMDS分析。

图2 海螺沟冰川不同演替阶段的细菌（A）和真菌（B）共生网络分析。

图3 海螺沟冰川不同演替阶段的细菌和真菌群落与环境因素的RDA（a,b）、VPA（c,d）和SEM（e,f）分析。AP速效磷；SOC土壤有机碳；TN总氮；TP总磷。实心箭头和虚线箭头分别表示正相关和负相关，箭头的粗细反映标准化系数大小。

上一篇：Accu16S^?细菌绝对定量测序
下一篇：微生物功能基因扩增子测序