人类基底细胞癌的单细胞分析揭示了肿瘤生长和肿瘤微环境的新调控因子

基底细胞癌（BCC）是一种局部浸润性皮肤癌，是世界范围内最常见的人类癌症，据估计终生风险在20%至30%之间，在北美、欧洲、亚洲和澳大利亚等许多地区发病率不断上升。基质如何与BCC相互作用并促进其生长尚不清楚。多项研究表明，BCC基质中表达的因子在肿瘤生长、血管生成和转移中发挥重要作用。因此，明确BCC与基质相互作用可能是研究肿瘤进展的一个重要部分，并最终形成更加有效的治疗。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术可以分析样本内异质性、肿瘤/样本微环境、致病途径和致癌背景下的细胞-细胞相互作用。2022年6月10日，加利福尼亚大学Scott X. Atwood和斯坦福大学医学院Kavita Sarin课题组在Science Advances杂志发文“Single-cell analysis of human basal cell carcinoma reveals novel regulators of tumor growth and the tumor microenvironment”。利用scRNA-seq技术定义了BCC的细胞异质性、细胞间相互作用以及BCC中新的活性通路，对恶性上皮和正常上皮进行区分，确定了由WNT5A驱动的基质炎症反应，描述了一个过表达热休克蛋白的BCC角质形成细胞亚群，并提供了支持热休克蛋白通路作为BCC潜在的新治疗靶点的数据。

首先，利用Chromium平台对4例原发BCC手术样本（4种亚型Ⅰ-Ⅳ）及2例癌周皮肤（PTS）组织进行scRNA-seq，共捕获52966个有效细胞，根据已知的标记基因发现主要由10种细胞类型组成（下图A，B）。通过InferCNV分析发现BCC-Ⅰ/Ⅱ/Ⅳ中KRT14⁺上皮细胞呈现异常的基因组特征，但是这一分析无法识别单个的恶性细胞。

为了确定一种方法能够识别BCC相关KRT14⁺上皮细胞/肿瘤细胞状态显著不同于PTS，研究比较了4种基于Seurat整合的聚类方法，包括SCTransform、LIGER、Harmony和scMC，发现scMC明显不同地聚集了BCC和PTS上皮细胞，但保持了转录相似的细胞类型的聚集。因此，采用scMC校正的数据用于后续分析，而且scMC保持了Seurat对单个BCC样本聚类的10种细胞类型（下图D，E）。

为了确定BCC和PTS样本中上皮/肿瘤细胞图谱，对KRT14⁺上皮细胞进行亚群分析，发现了15个上皮亚群，并采用免疫荧光染色对基因表达特征和空间结构进行了部分marker验证。作者利用pySCENIC对不同的上皮细胞群进行了基因调控网络分析，发现了BCC亚型特异的显著活性的调控子（regulons），包括FOX、HOX和SOX家族的转录因子。

为了确定人BCC和PTS区域成纤维细胞（FIB）/成纤维细胞样（FIB-like）是否存在异质性，对其重聚类共发现6个亚群。同样利用RNA原位杂交及蛋白免疫染色验证了成纤维细胞的基因表达特征和空间结构，结果发现了其中TMEM119⁺ FIBs在位置和密度上均明显与KRT14⁺肿瘤巢分离，进一步证实了BCC中成纤维细胞的瘤间异质性。进一步分析TMEM119⁺ FIBs所在cluster在BCC和PTS样本中的差异，发现WNT5A在BCC中过表达，而且与TMEM119共表达（下图）。

为了确定这些细胞是连续存在还是具有不同的细胞状态，作者使用细胞熵估计（CEE）计算了BCC和PTS中FIB/FIB样细胞的细胞熵。结果显示BCC中FIB总体熵值低于PTS，而 TMEM119⁺ FIB的稳定性最高，这表明FIB Ⅰ-III可能过渡到FIB IV（下图A-C）。结合RNA动态PAGA分析表明肿瘤基质可能发生重新配置（rewiring），使FIBs达到TMEM119⁺/WNT5A⁺的状态，从而支持肿瘤生长（下图D-G）。研究还利用Monocle2和scEpath分析发现参与TMEM119⁺/WNT5A⁺状态形成的转录因子。

FIB状态变化与BCC肿瘤生长如何相互影响尚不清楚。利用CellChat分析上皮/肿瘤和FIB/FIB样细胞之间的相互作用，以发现BCC和PTS微环境间信号通路的差异。结果确定与PTS相比，ncWNT通路在BCC中是一个高度活跃的主要信号通路，主要由WNT5A配体到卷曲受体FZD6、FZD7和FZD10所驱动。一些促炎反应信号在BCC中显示出更强的细胞交流，这些结果提示急性炎症信号可能与WNT5A的激活有关，而WNT5A又可能维持促炎状态，并在BCC基质中充当主要的炎症和应激信号中枢（下图F-I）。

为了确定FIBs的促炎反应如何影响肿瘤的生长和进展，研究在BCC和PTS上皮中寻找相关的差异表达基因，发现热休克蛋白（HSP）基因在BCC中显著上调。为了确定HSPs对BCC细胞的生长是否重要，作者通过使用HSP的抑制剂在细胞和在体模型中证实了单细胞的数据结果，并且发现HSPs，尤其是HSP70家族成员，作为潜在的BCC肿瘤生长和刺猬信号通路的新调控因子，可能为BCC的治疗提供一个新的治疗靶点。

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