盘点新型冠状病毒相关研究中单细胞转录组技术的应用（二）

原创上海天昊生物

2019冠状病毒病（COVID-19），由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起，据世界卫生组织统计，截至2021年9月2日，已造成2.18亿人感染，至少452万人死亡。单细胞RNA测序（scRNA-seq）在解析免疫反应方面有强大的能力，已被广泛应用于COVID-19的研究，现整理2021年以来部分重要研究中scRNA-seq相关内容供读者阅读参考：

●单细胞多组学

对人类血液免疫细胞的分析为协调应对病毒感染（如导致COVID-19的SARS-CoV-2）提供了见解。这项研究对来自130名不同严重程度COVID-19患者的横断面队列的超过78万个外周血单个核细胞进行了单细胞转录组、表面蛋白组和T、B淋巴细胞抗原受体分析。结果发现了表达补体转录本（CD16⁺C1QA/B/C⁺）的非经典单核细胞的扩张，它们隔离血小板，并被预测在COVID-19中补充肺泡巨噬细胞池。早期未定向的CD34⁺造血干/祖细胞向巨核细胞生成启动，伴随巨核细胞定向祖细胞扩张和血小板激活增加。严重疾病表现为CD8⁺ T细胞的克隆扩增和CD8⁺效应T细胞/效应记忆T细胞比例的增加，而循环滤泡辅助T细胞伴随轻度疾病。另外观察到在有症状的疾病中IgA2的相对丢失，尽管浆母细胞和浆细胞整体扩张。这项研究强调了促成COVID-19发病机制的协调免疫反应，并揭示了可以靶向治疗的离散细胞成分。

●死亡病例的肺单细胞图谱

呼吸衰竭是严重SARS-CoV-2感染患者死亡的主要原因，但肺部组织水平上的宿主反应尚不清楚。这项研究对19名死于COVID-19的患者和7名对照组患者的肺部约11.6万个细胞核进行了单核RNA测序，这些患者接受了快速尸检。综合分析确定了细胞组成、转录细胞状态和细胞间相互作用的重大变化，从而提供了对致命COVID-19生物学的深入了解。COVID-19患者的肺部高度炎症，异常激活的单核细胞来源的巨噬细胞和肺泡巨噬细胞密集浸润，但T细胞应答受损。与其他病毒和细菌引起的肺炎相比，单核细胞/巨噬细胞来源的白细胞介素-1β和上皮细胞来源的白细胞介素-6是SARS-CoV-2感染的独特特征。肺泡2型细胞处于炎症相关的短暂祖细胞状态，未能完全过渡到肺泡1型细胞，导致肺再生受损。此外，发现最近描述的CTHRC1⁺病理成纤维细胞的扩张，导致COVID-19迅速发生肺纤维化。对蛋白质活性和配体受体相互作用的推断确定了可能破坏有害环路的药物靶点。该图谱有助于解析致命的COVID-19，有助于我们了解COVID-19幸存者的长期并发症，并为开发治疗方法提供重要资源。

●抗原呈递细胞的单细胞图谱

COVID-19可导致危及生命的呼吸衰竭，炎症介质和病毒载量增加。这项研究利用单细胞RNA测序建立了一个高分辨率的血液抗原呈递细胞（APCs）图谱，包括15例中度或重度COVID-19肺炎患者在进入重症监护室或肺科第一天和第四天的样本以及4个健康的捐赠者。结果生成了一个包含81,643个APCs的独特数据集，包括单核细胞和罕见的树突状细胞（DC）子群。发现了重症患者特异性APCs抗病毒免疫防御的多过程缺陷：（1）浆细胞样DCs（pDCs，抗病毒免疫的关键效应器）中促凋亡通路的增加，（2）pDCs和CLEC9a⁺ DCs中固有传感器TLR9和DHX36的减少，（3）单核细胞亚群中抗病毒干扰素刺激基因的下调，（4）cDC1c⁺ DCs中MHC II类相关基因和MHC II类反式激活因子活性的降低，表明病毒抑制了抗原呈递。这些新的机制可以解释患者的病情加重，并建议修复缺陷免疫防御的策略。

●特异性B细胞单细胞图谱

分析记忆B细胞（MBCs）对抗SARS-CoV-2的进化对理解抗体二次暴露回忆至关重要。这项研究使用单细胞测序分析了38例COVID-19患者的SARS-CoV-2反应性B细胞。利用寡核苷酸标记的抗原诱饵，分离出了SARS-CoV-2刺突蛋白、核蛋白（NP）、开放阅读框8（ORF8）和地方性人类冠状病毒（HCoV）刺突蛋白特异性的B细胞。SARS-CoV-2刺突特异性细胞在急性感染和恢复期患者发病数月后的记忆中富集。在严重的急性感染中，大量的地方性HCoV反应性抗体分泌细胞群被鉴定出来，并具有高度突变的可变基因，表明预先存在免疫。最后，随着时间的推移，MBCs表现出对NP和ORF8的明显成熟，特别是在老年患者中。针对这些靶点的单克隆抗体在体内不具有中和和保护作用。这些发现揭示了抗体在感染过程中对非中和性细胞内抗原的适应性，强调了疫苗接种对诱导中和性刺突特异性MBCs的重要性。

●单细胞测序验证髓系受体表达

尽管有越来越多的证据表明SARS-CoV-2与免疫细胞相互作用，但大多数细胞几乎不表达SARS-CoV-2的典型受体——血管紧张素转换酶2（ACE2）。该研究使用了一个聚焦于髓细胞细胞受体的异位表达筛选，确定了几种C型凝集素（DC-SIGN、L-SIGN、LSECtin、ASGR1和CLEC10A）和Tweety家族成员2（TTYH2）作为SARS-CoV-2刺突的糖依赖结合因子。除了TTYH2外，这些分子主要通过受体结合域外的区域与刺突相互作用。来自COVID-19患者肺部细胞的单细胞RNA测序分析表明，这些分子主要在髓样细胞上表达。尽管这些受体不支持SARS-CoV-2的主动复制，但它们与病毒的结合在髓样细胞中诱导了与COVID-19严重程度相关的强大的促炎反应。研究还发现了一种双特异性抗刺突纳米体，不仅可以阻断ACE2介导的感染，还可以阻断髓系受体介导的促炎反应。这一研究结果表明，SARS-CoV-2髓系受体相互作用促进免疫过度激活，这是COVID-19治疗的潜在靶点。

●胰岛单细胞测序

最近的临床数据表明，COVID-19和糖尿病之间存在相关性。这一研究描述了COVID-19患者尸检样本中胰腺细胞中SARS-CoV-2病毒抗原的检测。体外感染的单细胞RNA测序和免疫染色证实，多种类型的胰岛细胞对SARS-CoV-2易感，引发细胞应激反应和趋化因子的诱导。在SARS-CoV-2感染后，β细胞中胰岛素表达较低，胰高血糖素和胰蛋白酶1等α和腺泡细胞标志物表达较高，提示细胞转分化。轨迹分析表明SARS-CoV-2诱导eIF2途径介导的β细胞转分化，该表型可被反式-综合应激反应抑制剂（trans-ISRIB）逆转。总之，本研究展示了SARS-CoV-2感染导致细胞命运改变的一个例子，为进一步了解COVID-19的发病机制提供了依据。

●多组学数据整合分析

多种模式的同时检测代表了单细胞基因组学的一个激动人心的前沿领域，需要基于多模式数据定义细胞状态的计算方法。这项研究引入“加权最近邻”分析，这是一个无监督的框架，用来了解每个细胞中每种数据类型的相对效用，从而实现对多种模式的综合分析。研究将该程序应用于CITE-seq数据集，该数据集包含211,000人外周血单个核细胞，包括228种抗体的panel以构建循环免疫系统的多模态参考图谱。多模态分析极大地提高了解决细胞状态的能力，使我们能够识别和验证以前未报道的淋巴亚群。此外，研究人员还验证了如何利用这一参考来快速比对新的数据集，并解释对疫苗接种和COVID-19的免疫反应。这一方法代表了一种广泛适用的策略用于分析单细胞多模态数据集，并超越转录组，寻找细胞身份的统一和多模态定义。

●B细胞单细胞VDJ+RNA测序

单克隆抗体（mAbs）是对抗 SARS-CoV-2及其变异的疫苗和治疗设计的重点。这项研究结合B细胞分选、单细胞VDJ、RNA测序和mAb结构来描述B细胞对SARS-CoV-2的应答。结果发现SARS-CoV-2特异性B细胞库由转录上不同的B细胞群组成，细胞产生强大的中和抗体（nAbs），定位于类似记忆和激活B细胞的两个细胞群。这两个细胞群与SARS-CoV-2刺突三聚体结合后，在冷冻电子显微镜下所选择的nAbs结构显示出对各种受体结合域（RBD）表位的识别。其中一种单克隆抗体BG10-19将刺突三聚体锁定在一个封闭的构象中，以有效中和SARS-CoV-2、最近出现的突变体B.1.1.7和B.1.351以及SARS-CoV，并与异种RBDs交叉反应。总之，这些结果描述了SARS-CoV-2特异性B细胞之间的转录差异，并发现了交叉中和抗体靶点，这将为针对冠状病毒的免疫原和治疗设计提供信息。

●mRNA疫苗接种+单细胞验证

在SARS-CoV-2出现后不到一年时间内紧急批准两种mRNA疫苗的使用，是疫苗学上的一个里程碑。然而，mRNA疫苗是如何刺激免疫系统引起保护性免疫反应的还不清楚。本研究使用系统疫苗学方法全面分析了56名健康志愿者接种辉瑞-拜恩泰科（Pfizer–BioNTech）mRNA疫苗（BNT162b2）后的先天和适应性免疫反应。接种第二次疫苗后，抗野生型SARS-CoV-2（来源于2019-nCOV/USA_WA1/2020）和B.1.351毒株（较小程度）的中和抗体大量产生，抗原特异性多功能性CD4和CD8 T细胞显著增加。与初级疫苗相比，强化疫苗刺激了明显增强的先天免疫反应，证据如下：（1）CD14⁺CD16⁺炎症单核细胞的频率更高；（2）血浆INFγ浓度升高；（3）先天抗病毒免疫的转录特征。与这些观察结果一致，单细胞转录组学分析表明，在二次免疫后，富含干扰素反应转录因子的髓细胞簇的频率增加了约100倍，而AP-1转录因子的频率减少了。最后，研究鉴定了与CD8 T细胞和中和抗体应答相关的独特先天途径，并表明单核细胞相关特征与针对B.1.351变体的中和抗体应答相关。总的来说，这些数据提供了对由mRNA接种诱导的免疫反应的深入了解，并证明了其在增强免疫后启动先天免疫系统发出更强回应的能力。

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