天昊生物微生物16S扩增子绝对定量测序技术再发好文

潍坊医学院杨洁教授课题组近期在《Carbohydrate Polymers》上发表了绿刺参岩藻糖基硫酸软骨素的链构象、理化性质及其体外发酵的文章。在这项研究中使用了天昊生物创新型的的微生物16S扩增子绝对定量测序技术。在恭喜客户发表文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文题目：Chain conformation, physicochemical properties of fucosylated chondroitin
sulfate from sea cucumber Stichopus chloronotus and its in vitro fermentation by human gut microbiota
中文题目：绿刺参岩藻糖基硫酸软骨素的链构象、理化性质及其体外发酵
期刊名：Carbohydrate Polymers
影响因子： 6.044

研究概要

本文采用HPSEC-MALLS和worm-like cylinder模型方法研究了绿刺参岩藻糖基硫酸软骨素(fCS-Sc)的链构象和理化性质，同时通过16S扩增子绝对定量测序研究它对人体肠道菌群的影响。结果表明绿刺参岩藻糖基硫酸软骨素(fCS-Sc) 在PBS中采用刚性棒状链构象，链构象参数分别为α_η（1.11）和α_h（0.70）。从worm-like cylinder模型推导出的刚度参数表明fCS-Sc表现为刚性链。刚果红分析显示为单螺旋结构。fCS-Sc在较宽的ph范围内表现出负的zeta电位和良好的热稳定性。此外，fCS-Sc还可以通过提高肠道菌群的绝对丰度来调节肠道菌群的群落结构，例如增加有益菌Megamonas、Bacteroides、Fusobacterium、Parabacteroides、Prevotella、Faecalibacterium，抑制病原微生物，从而促进短链脂肪酸的产生。本研究进一步加深了对fCS-Sc空间结构的认识，以及fCS-Sc作为益生元的应用。

研究背景

岩藻糖基硫酸软骨素（fCS）是从海参中提取的一种独特的天然硫酸软骨素类似物，含有硫酸岩藻糖支链。从不同海参中获得的岩藻糖基硫酸软骨素（fCS）结构各不相同。不同种类海参的fCS具有相似的硫酸软骨素骨架结构和不同硫酸基取代的岩藻糖分支。岩藻糖基硫酸软骨素（fCS）因其多种生物活性而受到广泛关注，它具有明显的抗凝、抑制肿瘤转移、抗病毒、改善高血糖等作用。
目前已经发现多糖的化学结构如单糖组成、糖苷结构、取代基、分子量和链构象对其活性有明显的影响。HPSEC-MALLS技术被广泛应用于多糖链构象的测定。近年来人们利用SEC-MALLS方法对fCS的链构象进行了研究。从刺参Apostichopus japonicus中提取的fCS在0.15 M NaCl（ph 7.4）中具有随机的线圈结构。在0.2M的NaCl溶液中， Isostichopus badionotus和Pearsonothuria graeffei 的fCS具有随机的螺旋构象。然而，从绿刺参中分离得到的fCS的链构象还没有研究。
近年来，生物活性多糖的益生元功能受到了广泛关注。肠道菌群作为一种功能器官，在人类健康与宿主饮食的相互作用中发挥着重要作用。同时，阐明益生元组分与肠道菌群之间的联系有助于其作为功能性食品的应用。由于人类消化系统不能产生足够的碳水化合物水解酶，肠道微生物群在多糖代谢中发挥着重要作用。肠道微生物群降解多糖，产生短链脂肪酸（SCFAs，如乙酸、丙酸和丁酸），在维持上皮屏障功能、调节上皮细胞增殖、调节免疫功能、预防结直肠癌等方面发挥重要作用。在我们之前的研究中，我们从绿刺参中获得了一种岩藻糖基硫酸软骨素（fCS-Sc），并对其化学结构进行了表征研究。为进一步阐明其构效关系，采用HPSEC-MALLS方法对链构象进行了测定，并worm-like cylinder模型方法进行了进一步的解释，研究了zeta电位和热稳定性等物理化学性质，同时也是首次对fCS-Sc的体外发酵进行了研究。

研究方法

fCS-Sc体外发酵：
根据文献报道，对fCS-Sc进行了体外发酵研究。将fCS-Sc或低聚果糖（FOS，阳性对照）溶于培养基中（10mg/ml），高压灭菌。新鲜粪便样本来自三名自愿捐赠者（两名女性和一名男性，年龄25-35岁），他们在三个月内没有胃肠道疾病或抗生素治疗。将每个供者的相同量粪便样本混合，用PBS稀释成10%（w/v）的粪浆，以500rpm离心5min，除去食物残渣。然后，将9ml空白培养基（对照组）或含fCS-Sc或FOS的培养基与1ml粪浆混合。将混合物立即放入厌氧培养箱中，37℃孵育24小时。在Silgreen阳离子交换柱（300×7.8mm）上分析培养基中的SCFAs含量，用8mM H₂SO₄洗脱，215nm检测。
16S扩增子绝对定量测序：
使用FastDNA™ SPIN Kit (MP Biomedicals, LLC, USA)提取样本微生物基因组DNA，然后在上海天昊生物科技有限公司进行16S扩增子绝对定量测序（V3-V4）。

研究结果

fCS-Sc的理化性质
HPSEC-MALLS-Visc-RI结果表明，fCS-Sc在PBS中呈刚性棒状链构象。M_w、[η]、R_h和构象参数α_η和α_h分别为63.2±0.6 kDa、64.1±0.3mL/g、9.62±0.03nm、1.11±0.01和0.70±0.01。根据类蠕虫柱体模型计算了更多的构象参数，结果表明，M_L，q，d， C_∞分别为793g/mol•nm、11.22±0.60nm、1.00nm和21.4，结果表明fCS-Sc具有一定的链刚度。刚果红试验表明，fCS-Sc具有高度有序的单螺旋结构。fCS-Sc在较宽的ph范围内呈现负zeta电位，热稳定性较好。
fCS-Sc对肠道菌群的影响
采用新鲜人粪便体外发酵和高通量测序分析，研究fCS-Sc对肠道菌群的影响。9个样品（3组，每组3个重复）共获得3099052条原始序列。在对原始序列进行过滤并以97%的相似性进行聚类后，每个样本获得254±19个OTUs。样本稀疏曲线和shannon曲线都表明测序深度覆盖了最大的多样性。不同组别产生的OTUs的venn图显示，所有组别共有246个OTUs。如表1所示，与对照组相比，fCS-Sc组的群落丰富度指数chao1和ACE指数显著高于对照组。fCS-Sc组的群落多样性指数（shannon指数）也明显高于对照组，这些结果表明fCS-Sc能促进肠道微生物的丰富性和多样性。

表1 不同组别的alpha多样性

主坐标分析（PCoA）结果表明，fCS-Sc处理后，三组菌群的微生物组成有明显的聚集性，微生物结构有明显的变化（图5a）。上述结论也得到了OTUs水平Bray-Curtis聚类分析结果的证实（图5b）

图5 基于主坐标分析（a）、聚类分析（b）的微生物群落结构差异研究

不同于以往对特定样品中微生物相对丰度的研究，靶向微生物在不同样品间的绝对丰度越来越受到关注。样品中微生物群的绝对定量是通过添加spike-in序列及其生成的标准曲线来实现的。各细菌类群在门水平上的相对丰度和绝对拷贝数如图6a所示，结果表明，随着fCS-Sc和FOS的处理，微生物组成发生了明显变化。尤其是fCS-Sc处理组的微生物绝对丰度是对照组的2.74倍，说明fCS-Sc是一种有效的益生元，能显著促进肠道微生物的生长。此外，FOS能促进微生物群的生长，比对照组增加1.33倍。在门的水平上，肠道微生物群主要由Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria、Fusobacteria组成（图6a）。厚壁菌/类杆菌比例 (F/B) 与高热量饮食引起的肥胖密切相关，从图6a可以看出，与对照组相比，fCS-Sc和FOS显著降低了F/B比值，分别从6.83降至1.55和3.12（p<0.05），说明fCS-Sc通过降低厚壁菌/类杆菌比值来有利宿主健康。结果还表明，fCS-Sc的发酵主要是由拟杆菌和梭杆菌引起的。在属水平上（图6b），肠道菌群主要由Escherichia/Shigella、Clostridium_XlVa、Megamonas、Dialister、Bacteroides、Fusobacterium、Bifidobacterium等组成，与对照组相比，fCS-Sc和FOS处理组的肠道菌群组成有明显变化，说明fCS-Sc和FOS能显著促进某些不同种类肠道菌群的生长。

图6 主要细菌在门（a）和属（b）水平上的相对丰度和绝对丰度

为了进一步阐明不同组之间的细菌组成差异，三组的肠道微生物群的热图如图7所示，人类肠道粪便中65种主要属发现有显著差异。将相对丰度低于1%的属从类群中剔除后，选出17个属进行比较，与对照组相比，fCS-Sc显著增加了Megamonas（1.26倍）、Bacteroides（5.18倍）、Fusobacterium（13.3倍）、Parabacteroides（6.11倍）、Prevotella（21.0倍）、Faecalibacterium（17.0倍）的丰度，降低了Clostridium_XlVa、Bifidobacterium、Dialister、Enterobacter、Phascolarctobacterium、Dorea的丰度。Megamonas可以产生醋酸盐来促进脂肪生成和胆固醇形成，它在FOS组中也有显著的增加，如先前报道一样。类杆菌是产生SCFAs的细菌，在维持微生物区系中起着重要的作用，可能与抗菌能力有关。Prevotella与难消化碳水化合物的水解有关，而且Prevotella增多可能会调节血糖，降低患糖尿病的风险。Bacteroides和Prevotella是两种利用fCS-Sc的有益肠道菌群，而Clostridium_XlVa被认为是条件致病菌，Dorea被认为是促炎症属，这两种菌在fCS-Sc组均明显减少。这些研究结果表明，fCS-Sc通过增加有益菌的数量和抑制病原微生物对肠道菌群具有调节作用。

图7 属水平肠道微生物组成的热图

发酵过程中产生的SCFAs
SCFAs（短链脂肪酸）是肠道菌群对不溶性多糖的主要发酵产物，对维持大肠正常功能和结肠上皮细胞形态具有重要作用。不同组别发酵24小时后的SCFAs含量见表2，结果表明，样品中的主要发酵产物为乙酸、丙酸和异丁酸。fCS-Sc能明显促进乙酸、丁酸和异戊酸的产生，另一方面，FOS处理使乙酸、丙酸含量显著增加，异丁酸含量显著降低。FOS组未检测到丁酸和异戊酸。

表2 体外发酵过程中短链脂肪酸的产生

研究结论

HPSEC-MALLS-Visc-RI结果表明，fCS-Sc在PBS中呈刚性棒状链构象。M_w、[η]、R_h和构象参数α_η和α_h分别为63.2±0.6 kDa、64.1±0.3mL/g、9.62±0.03nm、1.11±0.01和0.70±0.01。根据类蠕虫柱体模型计算了更多的构象参数，结果表明，M_L，q，d， C_∞分别为793g/mol•nm、11.22±0.60nm、1.00nm和21.4，结果表明fCS-Sc具有一定的链刚度。刚果红试验表明，fCS-Sc具有高度有序的单螺旋结构。fCS-Sc在较宽的ph范围内呈现负zeta电位，热稳定性较好。此外，fCS-Sc通过促进肠道菌群的丰富性和多样性，促进有益细菌生长和SCFAs（短链脂肪酸）的产生，对肠道菌群有显著的调节作用。本研究有助于了解fCSs的链构象及其在食品、医药等行业中的应用。

常规扩增子测序和qPCR技术痛点

常规16S扩增子测序技术虽然其具有高通量，低花费，可客观还原菌群结构及相对丰度比例的巨大优势，但是其是通过某一OTU分类单元的序列数所占总序列数的比值来获得某个细菌的相对丰度比例信息，然而相对丰度信息不能反映样本中物种真实的绝对丰度情况，例如微生物某一类群的相对丰度比例增加不一定真正是相应微生物类群的绝对丰度增加，可能是其它微生物类群的绝对丰度减少是导致其在群落结构中相对丰度比例的增长，因此常规16S扩增子测序技术基于相对定量分析的错误结果解释可能导致假定的因果关系！
qPCR绝对定量技术虽然可以进行物种绝对定量分析，但是qPCR定量实验结果常常不稳定，且特定物种qPCR需要设计特定引物，对引物特异性要求较高，且引物优化难度较大，导致常规的qPCR绝对定量实验不再适用于组成较为复杂的环境样本微生物绝对定量。此外，当环境样本中往往含有腐殖酸，这些腐殖酸会通过抑制酶的活性抑制PCR，从而影响qPCR对细菌拷贝数定量结果的准确性。

天昊16S扩增子绝对定量测序技术简介

该技术是一种将qPCR绝对定量技术和常规16S扩增子测序技术合二为一的技术，该技术不但可以进行Alpha多样性分析、群落组成分析、Beta多样性分析、指标和微生物相关性分析等常规16S扩增子测序分析，关键可以解析样本中总细菌的绝对拷贝数，还可以解析样本中每个物种的绝对拷贝数，因而对微生态学内许多悬而未决的问题具有进一步阐明的潜力。此外，该技术进行细菌拷贝数定量时，构建标准曲线的内标和样本DNA是在同一个样本孔中一起进行PCR反应，所以PCR反应效率相同，因此校正了腐殖酸对PCR的影响，避免了腐殖酸等PCR抑制物对样品细菌16S拷贝数定量的影响，因此针对土壤、水体和淤泥等环境样本，天昊生物16S扩增子绝对定量测序技术计算得到的细菌16S拷贝数相对于qPCR更准确。

天昊16S扩增子绝对定量测序技术应用情况

目前天昊微生物16S扩增子绝对定量测序技术平台已经完成项目近百个，合作单位包括中国科学院微生物研究所、中国科学院南京土壤研究所、中国科学院水生生物研究所、同济大学环境科学与工程学院、厦门大学环境与生态学院、中国农业大学、南京农业大学、东北农业大学、重庆市农业科学院、盐城工学院、南京财经大学、南京中医药大学、武汉大学中南医院、新疆医科大学公共卫生学院、山东大学齐鲁医院等多个单位，覆盖环境土壤微生物，环境水体微生物和医学肠道微生物等多个领域，利用该技术的项目文章成功发表在环境科学期刊《Science of the Total Environment》（IF= 5.589）和应用化学1区期刊《Carbohydrate Polymers》（IF=6.044）上，目前该技术因其创新性、准确性和稳定性受到客户的广泛好评！天昊生物目前是国内唯一一家提供 “微生物16S扩增子绝对定量测序”技术的服务商，热烈欢迎各位老师与我们交流沟通！